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植物组织培养
烟草的再生
前言 植物的组织培养广义又叫离体培养，指从植物体分离出符合需要的组织、器官或细胞，原生质体等，通过无菌操作，在人工控制条件下进行培养以获得再生的完整植株或生产具有经济价值的其他产品的技术。狭义是指组培指用植物各部分组织，如形成层、薄壁组织、叶肉组织、胚乳等进行培养获得再生植株，也指在培养过程中从各器官上产生愈伤组织的培养，愈伤组织再经过再分化形成再生植物。
在实践中，根据所培养的植物材料的不同，可以把组织材料分为5种类型，即愈伤组织、悬浮细胞培养、器官培养（胚、花药、子房、根和茎的培养等）、茎尖分生组织和原生质体培养。这5种培养类型虽然各有特点，但又相互有联系。例如，愈伤组织常常是悬浮细胞和原生质体的来源，但是很多情况下，悬浮细胞和原生质体最终又要通过形成愈伤组织才能产生再生植株。
19世纪30年代，德国植物学家施莱登和德国动物学家施旺创立了细胞学说，根据这一学说，如果给细胞提供和生物体内一样的条件，每个细胞都应该能够独立生活。1902年，德国植物学家哈伯兰特在细胞全能性的理论是植物组培的理论基础。1958年，一个振奋人心的消息从美国传向世界各地，美国植物学家斯蒂瓦特等人，用胡萝www.unjs.cOm卜韧皮部的细胞进行培养，终于得到了完整植株，并且这一植株能够开花结果，证实了哈伯兰特在五十多年前关于细胞全能的预言。植物组培的简单过程如下：剪接植物器官或组织——经过脱分化形成愈伤组织——再经过再分化形成组织或器官——经过培养发育成一颗完整的植株。植物组培的大致过程是：在无菌条件下，将植物器官或组织（如芽、茎尖、根尖或花药）的一部分切下来，用纤维素酶与果胶酶处理用以去掉细胞壁，使之露出原生质体，然后放在适当的人工培养基上进行培养，这些器官或组织就会进行细胞分裂，形成新的组织。不过这种组织没有发生分化，只是一团薄壁细胞，叫做愈伤组织。在适合的光照、温度和一定的营养物质与激素等条件下，愈伤组织便开始分化，产生出植物的各种器官和组织，进而发育成一棵完整的植株。 植物组织培养具有很多优点。第一，其培养条件可以人为控制，摆脱了大自然中四季、昼夜的变化以及灾害性气候的不利影响，且条件均一，对植物生长极为有利，
便于稳定地进行周年生培养。第二，其生长周期短，繁殖率高。第三，管理方便，利于工厂化生产和自动化控制，与盆栽、田间栽培等相比省去了中耕除草、浇水施肥、防治病虫等一系列繁杂劳动，可以大大节省人力、物力及田间种植所需要的土地。
组织培养一方面可为转基因育种提供理想的受体材料，另一方面又可为常规的植物改良程序提供一种新的手段，从而使很多用传统方法难以解决的问题迎刃而解，更多更快地创造出各种农作物和园艺植物的新品种、新类型和新种质。总的来看，组织培养在植物改良中发挥了主要的作用，相信随着培养的技术不断的进步，其将会发挥更大的作用。
一、 实验目的
1. 了解与掌握植物组织培养的原理和过程。
2. 了解与学习植物组织培养的相关操作技术。
3. 通过学习植物组织培养技术学习自我总结、自我反思，让自己在今后的学习与生活中也能像做组织培养那样细心、有条理。
二、 实验原理
动物细胞的分化一般是不可逆的，植物则不同。只要具有一个完整的膜系统和一个有生命力的核，即使是已经高度成熟和分化的细胞，也还保持着回复到分生状态的能力。
把已分化组织中不分裂的静止细胞从母体植株上分离下来置于一种能促进细胞增殖的培养基上培养，细胞内就会发生某些变化，例如在休止期间由于溶酶体的破坏活动而丧失了功能的细胞组分又恢复了功能等，从而使细胞进入分生状态。一个成熟转变为分生状态并形成未分化的愈伤组织的现象称作“脱分化”。在组织培养中，把如上述由活植物体上切取下来以进行培养的那部分组织或器官叫做外植体。外植体通常都是多细胞的，并且组成它们的细胞常常包括各种不同的类型，因此由一个外植体所形成的愈伤组织也是异质性的，其中不同的组分细胞具有不同的形成完整植株的能力，即不同的“再分化”能力。
一个植物细胞能产生一个完整植株的固有能力称这为细胞的全能性（Cell
totipotency）。换句话说，细胞全能性是指植物细胞具有全套遗传信息，不管是性细胞还是体细胞，在特定环境下仍能进行表达，而产生一个独立完整的个体。
细胞一旦脱离了母体植株，摆脱了原来所受到的遗传上的控制和生理上的制约，在一定的培养条件下，就会发生一种回复变化，从而失去分化状态，变为分生细胞，实现脱分化过程。然后，这些脱分化细胞经过连续的有丝分裂，形成愈伤组织，即指在人工培养基上外植体长出来的一团无序生长的薄璧细胞。
脱分化细胞不断进行分裂，从而形成了愈伤组织，愈伤组织在培养基上生长一段时间以后，由于营养物质枯竭，水分散失，以及代谢产物的积累，必须转移到新鲜培养基上培养。这个过程叫做继代。
当试管苗在瓶内长满并长到瓶塞，或培养基利用完时就要转接，进行继代，可迅速得到大量试管苗，以便到一定数量时进行移栽。能否保持试管苗的继代培养，是能否得到大量试管苗和能否用于生产的重要问题。
因此，按培养过程可分为初代培养和继代培养两种类型：
（1）初代培养（Primary culture）：指外植体的最初培养。
（2）继代培养（Subculture）：将初代培养得到的培养体移植于新鲜培养基中这种反复多次移植的培养，称为继代培养。
若按照组织培养的材料可分为：（1）组织、器官或细胞培养：指利用生物体各部分组织、器官或细胞进行离体培养，使之形成愈伤组织或完整有机体的技术。
（2）原生质体培养：指将微生物或植物细胞游离成原生质体，在适宜培养条件下，依据细胞全能性使其再生细胞壁，并进行细胞分裂分化，形成完整个体的技术。
植物组织培养过程为：
脱分化
再分化
三、 实验材料和仪器
材料：烟草的叶片， MS培养基所需的各类药品，蔗糖，琼脂，1mol/L的NaOH，
1mg/ml的6—ＢＡ，70%酒精，升汞溶液，无菌水
仪器：电子天平，玻璃棒，大烧杯，移液管，洗耳球，量筒，搪瓷杯，电炉，
ｐＨ计，漏斗，牛皮纸，培养皿，组培瓶，锥形瓶，滤纸，高压蒸汽灭
菌锅，无菌操作台，镊子，解剖刀，酒精灯
四、 实验步骤
（一）配制母液
１.根据书上的相关数据计算配制母液所需药品的用量，和小组其他成员检查核对数据，确定用量。（具体用量见表１）
２.将所需的药品准备好，按照表１的数据进行母液的配制，配制好后写好标签，按顺序摆放好母液。
注意事项：
1.计算配制母液药品用量时要小心仔细，不要出现计算错误。计算完毕后应和小组成员仔细核对，以确保计算无误。
2.在称取药品时一定要看清药品的名称和用量，例如不要将K2HPO4 看成是KH2PO4。
3.配制完母液后要写清标签，切勿弄混。
（二）MS培养基制备
1..在搪瓷杯里加入适量的水，按照表２，依次将溶液加入搪瓷杯中，搅拌。
2..将所得溶液定容到１Ｌ，调ｐＨ值，使ｐＨ＝６.０。
3.称取琼脂条10g，放入搪瓷杯中，放于电炉上加热，待琼脂条完全融化后将其
移开，置于室温下冷却。
4.待其冷却一会儿（不烫手时）后将其分装，总共分装18瓶。用牛皮纸包好瓶
口，扎上棉线。
5.将其和组培瓶、剪刀、镊子、培养皿、滤纸、装有适量水的锥形瓶放入高温灭
菌锅中灭菌。表1
表2
注意事项：
1. 调试pH值要在加热之前，因为温度会影响溶液的pH。
2. 在加热过程中要有人照看，以免溶液因为沸腾而喷洒出来。
3. 在分装时一定要小心，勿将液体培养基倒在瓶口上，如不小心沾上，要小心擦拭干净。
（三）初代培养的接种
1. 将所需用具组培瓶、培养皿、滤纸、镊子、解剖刀、无菌水从灭菌锅取出，准备好75%的酒精，升汞，酒精棉，酒精灯，将它们按一定顺序排好待用。
2..接种前用酒精棉擦手，然后换一块酒精棉擦拭工作台面，再换一块酒精棉擦拭镊子和解剖刀，在等待酒精挥发的同时将锥形瓶的棉线解开，将棉线理好后放在腿上。
3.采集一片长势完好的烟草叶片，用75%酒精浸泡数秒钟，然后用升汞溶液浸泡3min到5min，之后取出，用无菌水漂洗3次。
4.将消毒后的叶片置于无菌滤纸上，用解剖刀将叶片边缘和两端切去，留下主脉及其附近的叶肉，后将剩下的叶片切成1cm2左右大小的外植体。
5.左手拿装有培养基的锥形瓶底部，右手轻轻取下包头纸，将锥形瓶的瓶口靠近酒精灯火焰，瓶口倾斜，。然后用灼烧后冷却的镊子将外植体移入瓶中，叶片背面与培养基接触，轻轻按压使植物能紧贴培养基。镊子使用后放回消毒酒精中，将瓶口在火焰上旋转灼烧数秒钟，后包扎好瓶口，作好标记。
6.定期观察烟草的叶片的生长状况，及时记录并拍照。
注意事项：
1.用酒精棉给手和台面以及镊子和解剖刀消毒时要离酒精灯远一点，待酒精挥发干后才可以靠近酒精灯，避免发生危险。
2.用升汞消毒时要避免消毒时间过长，以免破坏其组织。在消毒过程中要适时晃动一下组培瓶，使叶片与升汞充分接触。
3.切叶片时切忌切的太小。
4.取下的牛皮纸向下摆放，放好叶片再次用牛皮纸包上锥形瓶之前要用火烧一下瓶口，切忌牛皮纸碰到瓶口。
五、 实验结果
第一次观察
第二次观察
六、 实验分析与讨论
通过照片可以看出，此次实验成功地长出了愈伤组织。愈伤组织在培养基上生长一段时间以后，由于营养物质枯竭，水分散失，以及代谢产物的积累，必须转移到新鲜培养基上培养。此次实验由于课时的限制，所以只进行了初代培养。
植物组织培养是看似简单实则是很不容易的一门技术。它要求我们每次做实验都必须要认真、仔细、有条理。不管是哪一次实验，只要其中的一个环节出错，就有可能导致整个实验的失败。所以，认真仔细有条理是做组培的基本条件。
在这次实验中，经过回想与总结，得出了以下的一些经验：
1.大量元素的配制：
首先是要确定药品，不要将药品名称看错。例如不要将K2HPO4 看成是KH2PO4。 这两样东西看起来虽然差不多，其实会对实验产生很大的影响。KH2PO4是酸性的，在此
次实验中和其他药品不会产生沉淀，而K2HPO4是碱性的，在此次实验中会和Mg2+形成
沉淀，影响实验。在配制大量元素无机盐母液时，还要防止在混合各种盐类时产生沉淀，各种药品必须在充分溶解后才能混合，同时在混合时要注意先后次序，把钙离子(Ca2+)、锰离子(Mn2+)、钡离子(Ba2+)和硫酸根离子(SO42-)、磷酸根离子(PO43-)错开，以免KH2PO4和MgSO4与CaCl2等发生作用，相互结合生成硫酸钙、硫酸钡、磷酸钙或磷酸锰沉淀。在混合各种无机盐时，其稀释度要大，慢慢地混合，同时边混合边搅拌。
2.微量元素的配制：
在配制微量元素混合母液时也要注意药品的添加顺序，以免产生沉淀。
3.铁盐的配制：
铁盐必须单独配制，因为与其他母液混合容易产生沉淀，在培养基中，采用螯合铁的形式配制，即硫酸亚铁和Na2-EDTA的混合物，在pH值7.6~8.0时也可保证铁的供应源。
4.母液的保存：配制好的母液应分别贴上标签，注明母液号、配制倍数、日期。
5.MS培养基配制过程，要注意调试pH是在加热之前，不能加热之后再调pH，因为温度会对其产生影响，会导致pH偏大。在分装的过程中要注意不要将培养基倒在瓶口
上，这样容易受污染。如不小心瓶口沾上，要小心将其擦拭干净。
6.初代培养接种过程，在开始的时候不要急着做实验，要将所有的东西准备好，先在大脑里演示一遍整个实验的过程以及注意事项，确定无误后再开始做实验。实验过程中一定要保持头脑冷静，做到有条不紊。
整个组培的学习过程是有趣的，通过这次的学习，知道了自己的一些不足，在以后的学习生活中，我会一点一点的改正。
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