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解硒菌9906―5B解硒率的响应面分析
摘要：筛选得到一种解硒菌9906-5B，利用含单质硒的煤矸石生产亚硒酸钠，以便有效防止化学法提取硒造成的环境污染。在培养基中加入单质硒，利用解硒菌9906-5B，根据单因素结果设计它的响应面试验。运用SAS软件对解硒因素参数进行统计分析，探讨单因素条件下9906-5B的解硒效果。结果表明，解硒菌9906-5B在pH 6.0温度30 ℃解硒菌发酵28 h条件下，解硒率达到79.10%。 关键词：9906-5B解硒菌；解硒率；响应面分析 中图分类号：Q939.96 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2016）24-6395-03 DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2016.24.019 硒是人体必需的微量元素之一，也是长寿元素。硒有抗癌、抗氧化作用，能够增强人体免疫力，拮抗有害重金属，能够保肝护肝，具有调节维生素A、维生素C、维生素E、维生素K的吸收与利用，调节蛋白质和酶及辅酶合成的功能，能够增强生殖功能。缺硒会导致克山病、大骨节病、心血管病、癌症、糖尿病等40多种疾病[1，2]。 湖北省恩施州富硒土壤资源丰富，表层土壤硒含量大于0.4 mg/kg的富硒地区面积约10 456 km2，占全州面积的43.63%，恩施市含硒碳质页岩出露面积850 km2，硒矿储量达50多亿t，新塘乡双河鱼塘坝的硒矿被称为“世界罕见和惟一独立工业硒矿床”，填补了全球无独立硒矿床的空白。核心矿区长6 km，宽1.5 km，面积0.88 km2，含硒量均值为3 637.5 mg/kg，含硒品位为230～6 300 mg/kg，探明具有工业开采价值的硒金属（工业纯硒）45.699 t，渔塘坝岩石中硒的含量最高达6 300 mg/kg，是国外已发现最高含硒岩石的11倍[3]。这些富硒碳质岩石中的硒主要以有机态、元素态和硫化物/硒化物态的形式存在[4]。这些矿物硒有效态含量低，不易被动植物吸收利用，并且硒往往与重金属伴生，人为在贫硒土壤中补充硒矿粉，有可能带来土壤的二次污染，但目前采用的酸碱法提取硒的方法，又会造成水体等环境污染。因此，本研究借鉴稀有金属和含量少的贵金属矿成功采用微生物选矿技术提取的方法，尝试利用微生物从硒矿石中提取硒，用单质硒配成培养基，使用筛选到的解硒菌9906-5B发酵，观察在不同条件下解硒菌对单质硒离子化的效果，探讨利用微生物从含硒矿石中提取硒的技术。 1 材料与方法 1.1 材料 解硒菌（湖北民族学院筛选，中国科学院北京微生物研究所鉴定）、单质硒纯度99%（湖北恩施市新塘乡双河鱼塘坝）。 试验设备：超净工作台（苏州净化SW-CJ-2FD）、恒温摇床（HQL150B中国科学院武汉仪器厂）、试管、培养皿、接种环、酒精灯、三角瓶（250、500 mL）。 试验试剂：牛肉膏、蛋白胨、氯化钠、盐酸、氢氧化钠均为分析纯，厂家均为国药集团化学试剂有限公司提供。 1.2 方法 1.2.1 解硒菌活化培养基配制及试管菌种制作 牛肉膏琼脂培养基：牛肉膏5 g、蛋白胨10 g、氯化钠5 g，琼脂1.5 g，去离子水1 000 mL，用10%盐酸或10%的氢氧化钠调整pH到7.2～7.6，分装在试管中，高压蒸气灭菌，取出摆斜面，在超净工作台上无菌接种活化菌种，制成试管种。 1.2.2 解硒菌摇瓶种子液培养基配制 种子液培养基（牛肉膏液体培养基）：牛肉膏5 g、蛋白胨10 g、氯化钠5 g，去离子水1 000 mL。每500 mL三角瓶装100 mL解硒菌摇瓶种子液培养基，接种试管菌种，置控温摇床培养。 1.2.3 解硒菌单因素解离单质硒方法设计 使用
第一文库网 牛肉膏液体培养基，温度30 ℃，发酵28 h，设摇瓶液体培养基pH分别为3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5，分别接菌种于控温培养基上；使用牛肉膏液体培养基，pH 5.5，发酵28 h，设摇瓶液体培养基培养温度分别为27.5、28.0、28.5、29.0、29.5、30.0、30.5、31.0、31.5、32.0、32.5、33.0 ℃，分别接菌种于控温培养基上；使用牛肉膏液体培养基，温度为30 ℃，pH 5.5，设摇瓶液体培养基发酵时间分别为17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28 h，分别接菌种于控温培养基上。 1.2.4 解硒菌复因素解离单质硒响应面试验设计 将单质硒用块煤煤粉配成单质硒含量为300 mg/kg的含硒材料，将10%解硒菌摇瓶种子液加入到解硒菌摇瓶种子液培养基（煤粉重量的50%）中，并用其拌匀煤粉，煤粉含水率达60%，堆积控发酵。解硒菌复因素解离单质硒响应面试验设计[5]见表1。 1.2.5 离子硒的检测方法 发酵处理样品送至湖北省恩施州硒产业研究院，采用液相色谱和原子荧光联用法检测离子硒含量，再用加入的单质硒减去检测的离子硒含量，求得解硒菌解硒率（mg/kg）[6]。 2 结果与分析 2.1 单因素对解硒菌解硒率的影响 2.1.1 不同pH对解硒菌解硒率的影响 测定不同pH对解硒菌解硒率的影响，结果如图1所示，在pH 5.5时解硒率最高，同时也适合解硒菌发酵的活性酸度范??。 2.1.2 不同温度对解硒菌解硒率的影响 由图2可知，随温度提高，解硒率不断上升，在30 ℃时达最大，温度继续升高解硒率反而下降，说明解硒菌活性被高温抑制。结果表明，30 ℃是解硒菌的适宜温度，其活性达最大。 2.1.3 不同发酵时间对解硒菌解硒率的影响 由图3可知，随发酵时间延长，解硒率不断增大，但当解硒菌发酵时间超过28 h后，解硒率不变，说明解硒菌解硒达到饱和。 2.2 响应面法优化试验 2.2.1 根据Box-Behnken试验设计方案 选取培养基pH（X1）、发酵温度（X2）、发酵时间（X3）3个影响因子，解硒率为响应值，试验设计结果见表2，在pH为6.0，发酵温度为30 ℃，发酵时间为28 h时，解硒率最高，为79.10%。 2.2.3 响应面分析 由响应面可知，发酵温度响应曲面最陡峭，对解硒菌解硒率作用最显著，其次是培养基的pH，再次是发酵时间。 3 小结 本研究将响应曲面法运用于优化解硒菌解硒工艺。经试验优化后的解硒菌解硒最佳工艺条件为：解硒菌发酵时间为28 h、pH 6.0、发酵温度30 ℃。此工艺下提取率为79.10%。 通过筛选解硒能力更强的菌种可提高解硒率。解硒菌种是客观存在的，通过育种手段可以获得解硒能力更强的菌种，提高解硒率，还可通过筛选混合菌提高解硒能力。 解硒菌将煤矸石中的单质硒分解为离子硒。用解硒菌生产亚硒酸钠生产工艺：将单质硒矿石磨成硒矿粉，加入解硒菌将硒矿石中单质硒降解成离子硒，加入适量的硒离子吸附剂，压滤、加热蒸发滤液，浓缩、结晶，加热烘干结晶-加硫酸反应-生成亚硒酸钠。与传统亚硒酸钠生产工艺相比不加大量强碱，可降低成本，加酸生产亚硒酸钠不向外排酸，生产中环境污染少。 参考文献： [1] 李 军，张忠诚.微量元素硒与人体健康[J].微量元素与健康研究，2011，28（5）：59-63. [2] 徐兵河，孙 燕.微量元素硒的防癌抗癌作用[J].中国新药杂志，1998，7（3）：176-179. [3] 彭祚全，黄剑锋.世界硒都恩施硒资源研究概述[M].北京：清华大学出版社，2012. [4] 韩文亮，朱建明，秦海波，等.恩施渔塘坝富硒碳质岩石中硒的形态分析[J].矿物学报，2007，27（1）：89-95. [5] 王 希，钟耀广，市川寿.响应面优化超声波快速提取鳕鱼皮中胶原蛋白的工艺研究[J].东北农业大学学报，2014，45（7）：117-123. [6] 王 欣，幸苑娜，?泽勇，等.高效液相色谱-电感耦合等离子体质谱法检测富硒食品中6种硒形态[J].分析化学研究报告，2013，41（11）：1669-1674.【解硒菌9906―5B解硒率的响应面分析】相关文章：
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