蛋白提取步骤
蛋白提取步骤
准备裂解液、蛋白酶抑制剂。
1、取2mlEP管加入500ul裂解液（已加入蛋白酶抑制剂）
2、取0.1g组织，充分剪碎后加入研磨器中，加入适量液氮，将组织研成粉末状。
3、将研磨后的组织转至加有裂解液的2mlEP管中。
4、冰上超声（超声3s，停6s）共计20个循环，30%能量。
5、冰上静置30min，每10min震荡1次。
6、12000rpm，4℃离心30min。
7、收集上清，测浓度后-70℃保存。
8、煮蛋白时加5微升上样缓冲液。
2．培养的细胞（定量）：
⑴ 去培养液后用温的PBS冲洗2~3遍（冷的PBS有可能使细胞脱落）。
⑵ 加入适量的冰预冷的裂解液后置于冰上10~20min。
⑶ 用细胞刮刮下细胞，收集在EP管后超声（100~200w）3s，2次。
⑷ 12000g离心，4℃，2min。
⑸ 取少量上清进行定量。
⑹ 将所有蛋白样品调至等浓度，充分混合沉淀后加loading buffer后直接上样最好，剩余溶液（溶于1×loading buffer）可以低温储存，-70℃一个月，-20℃一周，4℃ 1~2天，每次上样前98℃，3min。
3．组织：
⑴ 匀浆 对于心肝脾肾等组织可每50~100mg加1ml裂解液，肺100~200mg加1ml裂解液。可手动或电动匀浆。注意尽量保持低温，快速匀浆。
⑵ 12000g离心，4℃，2min。
⑶ 取少量上清进行定量。
⑷ 将所有蛋白样品调至等浓度，充分混合沉淀加loading buffer后直接上样最好，剩余溶液（溶于1×loading buffer）可以低温储存，-70℃一个月，-20℃一周，4℃ 1~2天，每次上样前98℃，3min。
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