不同产地莲子心及化学成分研究论文
摘要：：目的：评价并比较不同产地莲子心乙醇提取物及其部分化学成分的抗氧化能力。方法：采用DPPH法和ORAC法，评价了9个不同产地莲子心以及其中分离得到的9个化学成分的抗氧化能力。结果：湖南湘潭产地莲子心乙醇提取物对DPPH自由基清除的IC50值为101．65μg/mL，对氧自由基吸收能力的ORAC值为3．41（μmolTE/μg），在两种体外抗氧化测试模型中均表现出最好的抗氧化效果。莲子心分离得到的化学成分中黄酮类化合物对DPPH自由基清除能力强于生物碱类化合物，但是这两类化合物对ORAC氧自由基吸收能力并无显著性差异。结论：不同产地莲子心及其部分化学成分抗氧化能力在不同的评价体系中有一定的差异性，莲子心作为抗氧化剂具有进一步的研究价值。
关键词：：莲子心；抗氧化；DPPH；ORAC；生物碱；黄酮
莲子心（Plumulanelumbinis），又名莲薏、苦薏、莲心，为睡莲科莲属植物莲（NelumbonuciferaGaertn．）的成熟种子的干燥幼叶及胚根，其性味苦寒，具有清心安神，交通心肾，涩精止血的功效，主要产地分布在我国湖南、湖北、福建、江苏、浙江、江西、四川、山东等省［1］。
经研究发现，莲子心中活性成分主要包括生物碱类化合物，如：莲心碱、异莲心碱、甲基莲心碱、去甲基乌药碱、荷叶碱、前荷叶碱等［2－6］；以及黄酮类化合物，如：芦丁、槲皮素、山奈酚、金丝桃苷、水仙苷等［7－11］。研究表明莲子心中生物碱类化合物具有抗心律失常、降压、降血糖、抗癌、抗病毒等药理活性［12－15］，而其中的黄酮类化合物具有抗炎、抗菌、抗氧化等作用［16－18］。
在抗氧化研究方面，陈静［19］，郑铁松等［20］报道了莲子心的水提取液和乙醇提取液对Fenton体系产生的羟基自由基和邻苯三酚自氧化产生的超氧阴离子均有清除作用；张俊生等［21］报道了莲子心乙醇提取物具有清除羟基自由基及抗油脂氧化作用；杨小青等［22］报道了莲子心总生物碱对DPPH、ABTS+、羟基自由基和超氧阴离子具有很强的清除活性；陈铭等［23］报道了超微粉碎能明显提高莲子心的还原能力、DPPH和ABTS+自由基清除能力、总氧自由基吸收能力以及细胞内抗氧化活性。但是，尚未见文献有使4962用ORAC氧自由基吸收能力法对莲子心提取物进行体外抗氧化评价的报道，也未有文献对不同产地来源的莲子心的体外抗氧化的差异进行比较和评价。
近年来，随着自由基生物学的发展，越来越多的研究证明人体衰老、病变和慢性疾病的发病过程均和自由基以及活性氧有关。DPPH法最早由Blois报道，后经一系列修订，已在全世界范围内被广泛用于自由基清除能力的定量分析［24］。其原理为：1，1－二苯基－2－苦味酰基苯肼（1，1－diphenyl－2－picrylhydrazyl，DPPH）是一种稳定的自由基，其甲醇或乙醇溶液呈紫红色，在波长为517nm下有最大吸收峰。当有自由基清除剂存在时，DPPH的单电子被捕捉，溶液颜色由紫红色变为黄色，在最大吸收波长517nm处的吸光度变小。因此，可由吸光度的降低表示自由基清除率，清除率越大，样品抗氧化能力越强［25］。
而被译为抗氧化能力指数的oxygenradicalabsorbancecapacity（ORAC）方法，是目前抗氧化研究领域中为人们所关注的一个评价方法。其原理为：FL（disodiumfluorescein）作为荧光底物，在波长485nm激发下，可在波长527nm下发射荧光。以偶氮类化合物AAPH［2，2’－azobis（2－amidinopro—pane）dihydrochloride］热分解产生的过氧自由基（ROO）可将FL氧化，使其荧光特性消失。当抗氧化剂存在时，FL与其竞争氧化剂，从而抑制其荧光消退的速率。ORAC（ox—ygenradicalabsorbancecapacity）法以一种维生素E水溶性类似物Trolox（6－hydroxyl－2，5，7，8－tetramethylchroman－2－carboxylicacid）为定量标准，使用荧光微孔板分析仪进行分析［26－27］。本课题组前期建立了莲子心药材80%乙醇提取物的指纹图谱，对9批不同产地的莲子心药材进行了相似度评价以及其中生物碱含量的测定，结果表明不同产地莲子心样品无论在指纹图谱相似性以及生物碱含量方面均存在较大差异。为进一步考察不同产地来源的莲子心样品的体外抗氧化活性之间的差异，本课题组在前期研究基础上，采用DPPH法和ORAC法，评价了9个不同产地莲子心样品的抗氧化活性。同时，本课题组对莲子心的化学成分进行了初步的分离，得到了9个单体化合物，本实验采用DPPH法和ORAC法，评价了这9个莲子心主要化学成分的抗氧化能力，分析了生物碱和黄酮等不同种类的化学成分对莲子心药材总抗氧化能力的贡献，为莲子心的`进一步开发和利用提供了科学依据。
1材料与仪器
1．1材料与试剂
1．1．1材料9个不同产地莲子心购自不同的药材公司，具体产地来源如下：湖南湘潭、福建建宁、福建福州、安徽亳州、湖北洪湖、江西广昌、江西石城、山东微湖和四川成都，并经暨南大学张英副教授鉴定为莲子心（Plumulanelumbi—nis）。9个莲子心单体化合物由本课题组提取分离所得，并鉴定为：莲心碱、异莲心碱、甲基莲心碱、槲皮素、异槲皮苷、山奈酚、金丝桃苷、芦丁、水仙苷。1。1．2主要试剂1，1－二苯基－2－苦基肼（DPPH）、2，2’－偶氮二异丁脒盐酸盐（AAPH）、荧光素钠（FL）、VC、水溶性维生素E类似物（Trolox）均购于美国Sigma公司；磷酸氢二钠、磷酸二氢钾和无水乙醇均购于天津市大茂化学试剂厂；二甲基亚砜（DMSO，分子生物学专用）购于阿拉丁试剂公司；蒸馏水购于怡宝公司，以上试剂均为分析纯。
1．2主要仪器与设备
TECANInfinite200多功能酶标仪（奥地利公司）；PHS－3B雷磁PH计（上海精密科学仪器有限公司）；ML－104电子天平（上海梅特勒－托利多仪器有限公司）；移液枪（德国普兰德（Brand）公司）；GrenerBio－One96孔黑、白酶标板（德国葛莱娜第一生化股份有限公司）。
2方法
2．1莲子心的提取
分别称取9个不同产地莲子心药材100g，用12倍量80%（体积分数）的乙醇浸泡过夜，回流提取3次，每次2h，合并提取液浓缩至无醇味，冷冻干燥即得各产地莲子心乙醇提取物，备用。
2．2DPPH自由基清除能力测定方法
用DMSO溶解样品，并稀释成系列浓度。测定时采用96孔酶标板，设空白组（2×10－4MDPPH100μL+DMSO100μL）、样品组（2×10－4MDPPH100μL+待测样品100μL），阳性对照组（2×10－4MDPPH100μL+VC100μL），每组设3个复孔。震荡混匀后，室温避光放置30min，于波长517nm处测吸光度OD值。按如下公式计算待测样品的自由基清除率：自由基清除率=（OD空白－OD样品）/OD空白×100%。
2．3氧自由基吸收能力（ORAC）测定方法
测定使用96孔黑色酶标板，于避光环境中加样。经过预实验，对于不同产地莲子心乙醇提取物确定样品的初始浓度为6．25μg/mL，Trolox标准对照品和VC阳性对照的初始浓度为6．25μM，对于莲子心部分单体化合物确定样品、VC阳性对照和Trolox标准对照品的初始浓度均为6．25μM。依次每孔加入待测样品溶液20μL、PBS缓冲溶液20μL、荧光素钠溶液（FL）20μL。放入酶标仪中，37℃下震荡30s，孵育10min。接着，除了阴性对照组不加AAPH外，其余各空均加入140μL153mMAAPH溶液后，立即放入微孔板读数仪中，每2min记录1次荧光数值，记录120min。其中，阳性对照组加VC溶液，标准对照组加Trolox标准溶液。计算结果以抗氧化能力指数［27］（即抗氧化剂的氧自由基清除能力ORAC值）表示。
3结果与分析
3．1不同产地莲子心乙醇提取物的体外抗氧化能力比较
3．1．1DPPH自由基清除能力测定9个不同产地莲子心DPPH自由基清除率的IC50值见表1。以VC（IC50为4．96μg/mL）作为阳性对照组，比较发现不同产地莲子心乙醇提取物DPPH自由基清除能力依次为：湖南湘潭＞江西广昌＞福建福州＞福建建宁＞四川成都＞湖北洪湖＞江西石城＞安徽亳州＞山东微湖。
其中，湖南湘潭产地莲子心乙醇提取物DPPH自由基清除能力最强。3．1．2氧自由基吸收能力（ORAC）测定9个不同产地莲子心氧自由基吸收能力ORAC值见表2。以VC（ORAC值为3．40μmolTE/μmol）作为阳性对照组，比较发现不同产地莲子心乙醇提取物ORAC值依次为：湖南湘潭＞江西广昌＞福建建宁＞湖北洪湖＞江西石城＞山东微湖＞四川成都＞安徽亳州＞福建福州。其中，湖南湘潭产地莲子心乙醇提取物氧自由基吸收能力最强，ORAC值为3。41。以OringinPro8．5统计软件作图，结果见插页ⅩⅤ图1。表1不同产地莲子心DPPH自由基清除能力IC50值（n=3）
3．2莲子心部分化学成分的体外抗氧化能力测试
3．2．1DPPH自由基清除能力测定莲子心部分化学成分DPPH自由基清除率的IC50值见表3。以VC作为阳性对照，比较发现莲子心部分单体化合物中黄酮类化合物DPPH自由基清除能力表现较好，生物碱类较差。3．2．2氧自由基吸收能力（ORAC）测定莲子心部分部分化学成分氧自由基吸收能力ORAC值见表4。以VC作为阳性对照，比较发现莲子心部分单体化合物ORAC值与阳性对照组相差无几，生物碱类和黄酮类化合物表现出无明显差异。其中，金丝桃苷氧自由基吸收能力最强，ORAC值为4．02。以OringinPro8．5统计软件作图，结果见插页ⅩⅤ图2。
4结论
4．1不同产地莲子心乙醇提取物体外抗氧化能力综合评价
通过DPPH自由基清除法和氧自由基吸收能力（ORAC）法测定9个不同产地莲子心乙醇提取物抗氧化能力，综合评价发现：湖南湘潭产地莲子心乙醇提取物在两种评价体系中均显示出最强的抗氧化能力，另外江西广昌和福建建宁产地的莲子心乙醇提取物也表现出较强的抗氧化能力。
4．2莲子心单体化合物体外抗氧化能力综合评价
通过DPPH自由基清除法和氧自由基吸收能力（ORAC）法测定9个莲子心单体化合物，发现在不同的评价体系中同种单体化合物抗氧化能力表现有差异性，总体表现为对DPPH自由基清除能力黄酮类化合物较好，对氧自由基吸收能力生物碱类和黄酮类化合物无明显差异，也进一步证实了不同种类单体化合物的抗氧化机理有所不同，从而对总抗氧化能力有不同的贡献。本实验对9个不同产地莲子心乙醇提取物抗氧化作用的研究，发现不同产地莲子心乙醇提取物体外抗氧化能力差异较大，因此在今后的研究中以该实验结果为指导，选择合适产地的莲子心药材。
同时，发现莲子心中生物碱类和黄酮类化合物的抗氧化活性在不同的评价体系中也表现有差异，不同产地莲子心生物碱类和黄酮类化合物含量不同可能导致了其乙醇提取物体外抗氧化能力的差异。本实验为进一步探索莲子心化学成分与其药理活性之间的关系、在预防和治疗自由基诱发的疾病及延缓衰老等方面提供科学依据。
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